FRET Peptides

FRETとは蛍光共鳴エネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer)、またはフェルスター共鳴エネルギー移動(Förster resonance energy transfer)の略です。

FRETは初期励起ドナーからアクセプターへ励起状態のエネルギーが移動する現象です。ドナー分子は一般的にアクセプターの吸収波長と重なる短い波長でエネルギーを放射します。/

そのプロセスは光子放出を伴わない2分子の、電子的励起状態の間に起こる距離依存性の相互作用です。

FRETはペプチドフォールディングの立体構造の研究に用いられます。FRETペプチドは酵素研究において適切な基質として広く用いられており、以下のような例があります。

1. ペプチダーゼ／プロテアーゼ／キナーゼ／ホスファターゼの機能的特性解析
2. ペプチダーゼ／プロテアーゼ／キナーゼ／ホスファターゼの速度論的特性解析
3. 新規のタンパク質分解酵素のスクリーニングと検出

Chromophore/Fluorophore - Quencher Pairs

Q & A

Q　クエンチャーはどのように働きますか。

A　クエンチャーは非常に効率よく特定の波長を吸収します。近接の色素が吸収される波長でエネルギーを放射すると、光が「クエンチ(消光)」され、不可視となります。クエンチャーは色素と非常に似た構造になっています。両者の相違点は検出不可能な範囲に放射するか、または、検出不可能な量で放射するかです。ほとんどの場合、消光する能力は色素からの距離と相関しています。分子ビーコンではクエンチャーが色素と実際に接触することで消光効果を発揮します。様々な色素に対して最適なクエンチャーがあります。

Q　色素はタンパク質またはペプチドの内部で結合させることができますか。

A　はい、結合できます。色素のスクシンイミジルエステル基を用いて、N末端やリジン側鎖のアミノリンカーに結合させます。ほかのオプションとしてLys-FAMまたはLys-TAMRAをペプチド固相合成法(Solid-phase peptide synthesis、SPPS)に用いることがあります。これらの色素はすでにリジン側鎖のアミノリンカーと結合されています。

Q　5-FAMおよびFITCで標識されたタンパク質やペプチドの違いは何ですか。

A　5-FAM (5-カルボキシフルオレセイン、単一異性体)とFITC (フルオレセイン-5-イソチオシアネート、異性体)は蛍光色素フルオレセインの一種です。FITCはイソチオシアネート反応性種である特定の色素の種類です。第一級アミンと反応する際に尿素結合を形成します。5-FAMはタンパク質またはペプチドの標識に推奨される試薬です。第一級アミンとするときに、アミド結合を形成します。化学的性質はより強固で反応性が高いものです。さらに、5-FAMは光退色が少ないことが示されています。5-FAMおよびFITCに結合されたタンパク質やペプチドは類似の分光特性を持っています。

Q　リストにない色素や修飾品を使えますか。

A　はい、使えます。お探しの色素や修飾品をお伝えください。市販されているものでしたらお探しいたします。そうでないものについては、自社で製造できる可能性があります。どちらもできない場合は、最善を尽くして同様の結果をもたらすような色素や修飾品をお探しいたします。適切なオプションがお決まりでしたら、見積書をお送りします。

Q　蛍光標識したタンパク質またはペプチドの吸収極大値と発光極大値は？

A　スペクトルデータをご用意できます。これらの値は蛍光色素の製造業者から提供されており、通常はタンパク質またはペプチドに結合していない状態の色素から測定されています。原則的に、色素がタンパク質またはペプチドに結合する際、これらの値は変わることがあったとしてもほとんど変化しません。したがって、一般的なタンパク質またはペプチドをご使用いただく場合はこの値で問題ありません。タンパク質またはペプチドの特定の塩基組成は、多くの場合、特定のフルオレセイン関連色素においてpHの指標に利用できます。

Q　2種類の色素またはほかのコンジュゲートと結合したペプチドを調製できますか。

A　この答えは、ペプチドに様々な結合を配置できるため複雑ですが、結合と互換性の問題で利用可能なものによっては制限があります。 もっとも容易な方法は、一方または両方のコンジュゲートが、システインのチオールまたは支持体結合の試薬の両方またはどちらか一方としてとして利用可能な場合です。 少なくとも一方の試薬が利用可能な場合は、もう一方のコンジュゲートは第一級アミンを通してペプチドの一方の端部にしばしば結合されます。 このようなケースでは化学的適合性は避けられています。どちらのコンジュゲートもシステインのチオールまたは支持体結合の試薬として利用できない場合は、しばしばチオールリンカーとアミノリンカー両方を組み込んだ直交リンカーを用います。 これには、中性pH条件下でチオール特異性のあるマレイミドとして利用可能なコンジュゲートが必要です。一般的に用いられる色素のほとんどはスクシンイミジルおよびマレイミジルのエステル形態で利用可能です。もっとも一般的なフルオレセインのようにTET、HEX、TAMRA、Cy5、およびCy3も第一級アミンまたは支持体結合の試薬として利用可能です。ご注文の際はご要望のペプチドの設計をお手伝いいたします。また、利用可能な色素の詳細な情報は別項目をご覧ください。

Fluorescein Peptide Modifications - Dyes and Quenchers

AMC (7-Amino-4-methyl-coumarin)

キュベットを用いた酵素アッセイ用、またはフローサイトメトリー用のUV励起性色素です。

Cy3, Cy5

Cy3、Cy5は吸光係数が非常に高い蛍光色素です。したがって、細胞内ペプチドの高感度の局在アッセイに特に適しています。短所はペプチド合成の条件下では分子が非常に不安定であることです。そのため反応性は比較的低くなります。

Dabcyl

ダブシルは、ほかの蛍光色素分子(特にフルオレセイン色素やEDANS)のクエンチャーとして主に用いられる非蛍光色素です。ダブシルは蛍光色素分子に近接するペプチドと結合した場合、蛍光色素分子から放出された光を吸収します。この距離を拡大することで(すなわち、ペプチドの酵素的切断によって)検出可能な発光シグナルをともなって蛍光色素分子が励起されます。

Dansyl

ダンシルは蛍光色素のクエンチャーとしても用いられます。ダブシルと異なり、自身の蛍光色素を受け継ぐので高感度のアッセイには有用ではない可能性があります。

2,4-Dinitrophenyl (DNP)

2,4-ジニトロフェノール(DNP)は蛍光色素のクエンチャーとして用いられる非蛍光色素です(詳細はダブシルを参照)。

DNP-Lysine

DNP-リジンは、カスタムペプチドに対して、蛍光色素のクエンチャーとして用いられる非蛍光色素です(詳細はダブシルを参照)。

EDANS (5-((2-aminoethyl)amino)napthalene-1-sulfonic acid)

EDANSはクエンチャーにダブシルを用いてFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)ペプチドに一般的に用いられる色素です。

Fluorescein

フルオレセインは共焦点レーザ顕微鏡とフローサイトメトリーのアプリケーションに一般的に用いられる蛍光色素です。

NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazole)

NBDはアミン修飾に用いられる蛍光色素です。

p-Nitro-Aniline

p-ニトロアニリンはキュベットの様々な標準的酵素アッセイで比色酵素基質として用いられる色素原です。

Rhodamine B

ローダミンBは数多くあるローダミン色素の代表的な一種で、蛍光ペプチドアッセイに用いられます。

Tamra

Tamraは蛍光アッセイにもっとも一般的に用いられるローダミン色素です。

次の表では、ライフサイエンス分野でお客様の関心が高い、ペプチドの標識にもっとも一般的に用いられている蛍光色素分子の特性を記載しています。

蛍光色素分子の吸収波長は325nm～743nm(青色～赤色)、発光波長は386nm～770nmです。